慢病毒介导的热休克蛋白70基因对缺血/缺氧诱导嗜铬细胞瘤细胞内钙通道调节机制的研究
【出 处】:
【作 者】:
刘媛
[1] ;
关纯
[1] ;
郭璐璐
[2] ;
李庆淑
[1] ;
王芸
[2] ;
谢春雨
[2] ;
胡丹
[1] ;
曲彦
[1]
【摘 要】
目的:探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)基因表达对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤(PC12)细胞内质网钙稳态的影响及钙通道的调节机制。方法取对数生长期的PC12细胞,分为重组慢病毒感染组〔感染含HSP70及绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒〕、慢病毒对照组(感染含GFP但不含HSP70基因的慢病毒)及未感染组。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测PC12细胞经缺血/缺氧处理4、8、12、24h后的细胞活性,以选取最佳缺血/缺氧时间。采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测缺血/缺氧8h时HSP70、肌质/内质网Ca2+-ATP酶亚型(SERCA2a、SERCA2b)、兰尼碱受体2(RyR2)、三磷酸肌醇受体1(IP3R1)的mRNA转录水平;采用蛋白质免疫印迹试验(WesternBlot)检测缺血/缺氧8h时HSP70、SERCA、IP3R的蛋白表达水平;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)及游离钙离子([Ca2+]i)水平。结果随着缺血/缺氧时间延长,各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势,均于8h时达峰值。缺血/缺氧8h时,重组慢病毒感染组细胞活性较未感染组和慢病毒对照组均明显升高〔A值(×10-2):20.3±2.2比14.1±2.1、15.0±1.6,均P<0.01〕,HSP70和SERCA的mRNA及蛋白表达均明显上调〔HSP70mRNA(2-ΔΔCt)为0.785±0.018比0.428±0.019、0.423±0.023,HSP70蛋白(灰度值)为2.72±0.20比1.56±0.36、1.63±0.41,SERCA2amRNA(2-ΔΔCt)为0.971±0.037比0.367±0.014、0.347±0.012,SERCA2bmRNA(2-ΔΔCt)为8.869±0.162比3.015±0.091、2.941±0.091,SERCA蛋白(灰度值)为2.84±0.18比1.48±0.26、1.52±0.29〕,IP3R2的mRNA及蛋白表达均明显下调〔IP3R2mRNA(2-ΔΔCt)为0.183±0.020比0.439±0.020、0.433±0.040,IP3R2蛋白(灰度值)为1.15±0.12比1.91±0.20、1.83±0.19〕,差异均有统计学意义(均P<0.01),而RyR1mRNA表达差异无统计学意义〔2-ΔΔCt(×10-3):1.97±0.63比2.02±0.22、2.01
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