人Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离培养及表型维持研究
【出 处】:
肺泡上皮细胞
Ⅱ型
原代细胞培养
表面活性物质
板层小体
人
【作 者】:
吴松林
;
毛璞
;
傅成
;
莫红樱
;
何为群
;
刘晓青
;
黎毅敏
【摘 要】目的建立人Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)分离、纯化、原代培养及鉴定的方法,探索体外培养的表型维持情况。方法取手术切除的边缘肺组织,用胰酶、弹性蛋白酶联合法消化分离人ATⅡ细胞粗悬液,经过滤、差速贴壁、密度梯度分离、磁珠分选纯化。用肺表面活性蛋白C前体(pro-SP-C)免疫荧光、溶酶体绿色荧光染料(Green DND-26)荧光探针染色以及透射电镜鉴定人ATⅡ细胞;用pro-SP-C免疫荧光法和Green DND-26荧光探针染色法评估细胞纯度;锥虫蓝染色法评估细胞活性;并运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外培养过程中肺表面活性蛋白(SP-A、SP-B、SP-C、SP-D)的表达情况。结果人ATⅡ细胞产量为(5~10)×10^5/g;锥虫蓝染色细胞活性为(93±2)%;pro-SP-C免疫荧光、Green DND-26荧光探针鉴定、评估细胞纯度一致,为98%左右,透射电镜下观察ATⅡ细胞特有的板层小体结构清晰可见。SP-A、SP-C表达持续时间在24d左右(SP-A16d:0.52±0.03,20d:0.35±0.02,24d:0.26±0.01,28d:0.10±0.08;SP-C16d:0.68±0.16.20d:0.31±0.04,24d:0.18±0.06,28d:0.14±0.09),SP-B、SP-D表达持续时间可在28d左右(SP-B16d:1.05±0.17.20d:0.76±0.35.24d:0.55±0.15,28d:0.36±0.19;SP-D16d:0.52±0.19,20d:0.33±0.12,24d:0131±0.04,28d:0.23±0.02)。结论成功建立了一种分离、纯化及鉴定人ATⅡ细胞的方法,此方法能较持久维持ATⅡ细胞表型。
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