整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立
【出 处】:
高迁移率族蛋白B1
人脐静脉内皮细胞
转染
脓毒症
短发夹RNA
【作 者】:
张晓娟
;
栾正刚
;
马晓春
【摘 要】目的构建针对高迁移率族蛋白B1(HMGBl)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)。方法根据HMGBl基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA—u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达。结果酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致。HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGBl在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510±0.0200比1.0210±0.0110,均P〈0.05)。结论成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA—HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础。
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